近日，武漢友芝友生物制藥有限公司（以下簡稱“友芝友生物”）分析與質控團隊完成了報告基因法檢測CD38×CD3雙特異抗體生物學活性的研究,其研究論文 “Development of a Reporter Gene Method to Measure the Bioactivity of Anti-CD38×CD3 Bispecific Antibody” 發表于Antibody Therapeutics期刊上。

友芝友生物自主研發的抗CD38×CD3雙抗體（Y150）是基于YBODY®平臺技術開發的非對稱性雙特異性抗體。體內外研究表明，Y150能激活T細胞，并有效殺傷表達CD38的腫瘤細胞。在雙抗的開發過程中，建立一種能反映雙抗體作用機制（MOA）的細胞生物學活性評價方法非常重要?；诩毎拘缘臋z測方法如CCK-8，MTS，MTT，LDH等，可以以外周血單核細胞（PBMC）或T細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）為效應細胞，直接檢測對腫瘤細胞的殺傷作用，但由于這些效應細胞難以獲取，且存在較大的個體差異，因此不適合作為雙抗生物學活性的評價方法。

近年來，基于細胞水平的報告基因法廣泛應用于檢測單克隆抗體和雙抗的生物學活性。檢測以CD3為靶點的雙抗時，雙抗一端與腫瘤細胞相關的靶點結合，另一端與工程改造的Jurkat T細胞上的CD3結合，激活T細胞反應元件（NFAT-RE）介導表達的螢光素酶，與外加的螢光素酶底物反應，其化學發光強度可定量檢測雙抗的生物學活性（圖1）。

圖1 報告基因法檢測CD3靶點雙抗生物學活性

當采用報告基因法檢測Y150的生物學活性時，由于Jurkat T細胞上同時表達CD38和CD3，在沒有腫瘤細胞存在的條件下，兩個Jurkat T細胞會通過雙抗的連接而自我激活，產生非特異性信號，從而干擾實驗（圖2，綠色）。利用CRISPR-Cas9技術敲除Jurkat T細胞上CD38的表達，并構建穩定的單克隆細胞株進行Y150生物學活性檢測（圖2，藍色），成功消除了非特異性信號（圖2，棕色）。該方法操作簡便，檢測時間周期較短，分析方法驗證結果表明該方法在50%-200%范圍內具有良好的準確度、精密度、線性，以及穩健性（表1），可用于抗CD38×CD3雙抗體的QC放行檢測和穩定性研究。

圖2 Y150報告基因法檢測Y150生物學活性方法建立

表1 報告基因法檢測Y150生物學活性方法學驗證結果

在Y150的高溫穩定性研究中，報告基因法、細胞殺傷法和ELISA法測定的結果與CEX-HPLC法測定的電荷異質體之間存在高度相關性，生物學活性或相對結合活性的降低與酸性電荷異質體的增加呈線性相關，且這三種活性檢測法測定的相對效價變化趨勢一致（圖3），進一步說明本研究建立的報告基因檢測可以反映Y150的作用機制，能反應T-細胞招募類雙抗體雙靶點的協同效應，用于其生物學活性的評估及質量控制。

圖3 三種活性檢測方法相關性研究結果

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